酶解法分离、培养大鼠心房肌细胞,并通过观察细胞形态、透射电镜观察超微结构以及免疫荧光检测α-actin的表达等方法鉴定细胞。 2.利用培养的心房肌细胞建立快速电场起搏模型。 3.利用免疫细胞化学染色、RT-PCR以及Western-blotting等方法检测快速起搏不同时间后L-型钙通道α1c和钾通道Kv4.3的表达变化。 4.利用激光共聚焦显微镜检测不同条件下心房肌细胞游离钙荧光强度。 5.给予快速起搏24 h后,利用免疫细胞化学和Western-blotting等方法检测ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK、CaM、CaMKⅡ以及p-CREB等的表达。 6.分别给予L-型钙通道、ERK、p38MAPM、CaM和CaMKⅡ特异性阻断剂或拮抗剂预处理后,给予快速电场起搏24 h,然后利用RT-PCR以及Western-blotting方法检测L-型钙通道α1c和钾通道Kv4.3的表达变化。 7.构建CREB siRNA表达载体,了解其对CREB基因的沉默作用及其对离子通道重构的影响。 研究结果: 1.成功分离培养了大鼠心房肌细胞,经鉴定细胞活力、纯度能够满足实验需要。
2.成功构建了快速电场起搏的细胞模型,MTT法检测发现细胞活性与起搏前无明显差异,透射电镜可观察到细胞空泡样改变等。
研究背景 下腰痛是一个重要的公共卫生问题,给家庭和社会带来沉重的负担。虽然引起下腰痛的原因很多,但是椎间盘退变仍是主要因素。目前临床应用的治疗方法主要解决临床症状,而非针对退变早期的病理过程,并未延缓或逆转椎间盘退变。关于椎间盘退变的原因,虽然做出了许多有益的探讨,但其确切发病机制仍然不清楚。只有在全面了解椎间盘退变机理之后,才可能进一步研究阻止其退变甚或使其再生的方法。 目前的观点认为,椎间盘退变是一个由生物化学和生物力学因素相互作用的复杂病理过程。椎间盘始终处于负荷状态,尤其是椎间盘纤维环细胞总是受到不同形式的拉伸应力作用。纤维环蛋白多糖含量的下降和/或成分的改变,可以引起纤维环的退变,进而导致整个椎间盘退变的发生。Aggrecan是椎间盘中蛋白多糖的主要成分。小鼠的Aggrecan基因突变后,可以发生椎间盘的退变。同时椎间盘蛋白多糖的更新速率较快,对外界刺激更为敏感。在本实验中采用周期性张应变模拟作用于纤维环的张应力情况,观察其对椎间盘纤维环细胞蛋白多糖表达的影响。 AG-014699供应商 力学信号转化为生物化学信号是一个非常复杂的过程,涉及到很多细胞内、外成分。在很多类型的细胞中,力学刺激可以使细胞内钙离子浓度升高和ERK1/2发生磷酸化,因此,钙离子和ERK1/2信号通路被认为是细胞力学信号转导的共同通路。至于纤维环细胞是如何将机械应力这一力学信号转化成为细胞的生物化学信号,目前对其过程了解甚少。本实验对纤维环细胞力学信号转导的过程进行探讨,旨在揭示机械应力在纤维环退变中的作用,从生物力学角度探讨椎间盘退变的发生机理。
实验方法 1.大鼠椎间盘纤维环细胞的培养和鉴定采用酶消化法分离大鼠椎间盘纤维环细胞,进行单层培养,观察其形态结构和生物学特性,通过甲苯胺蓝、免疫细胞化学和碱性磷酸酶染色、透射电镜观察等方法对其表型进行鉴定。 2.种植于硅橡胶膜上的大鼠纤维环细胞的表型特征研究
在应激过程中，机体除了促进下丘脑-垂体-肾上腺轴分泌促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和糖皮质激素(GC)调节免疫功能外，还能产生另一类应激激素，生长激素(GH)和催乳激素(PRL)，这些激素分泌和合成的调节机制及其在感染、炎症等应激反应中的作用正越来越受到学者们的关注。研究发现，免疫细胞分泌的细胞因子及其受体可在下丘脑、垂体腺中表达，并对垂体细胞的增殖、分化和GH的分泌有一定的调节作用，那么，这些细胞因子对GH的合成有无调节作用?具体的调节机制是怎样的?目前尚未见报道。本研究以大鼠垂体GH3和MtT／S细胞作为垂体分泌GH的细胞，采用酶免疫分析法和荧光素酶报告基因的方法，从细胞和基因分子水平研究细胞因子(包括IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-11、CNTF、TGF-β、激活素)对垂体细胞中人GH(hGH)基因表达(包括转录水平和翻译水平的表达)的调控作用及其机理。 所以 MK-1775体外 1．含人GH(hGH)基因启动子序列(-484～+30bp)的荧光素酶表达质粒484-Luc2的克隆和稳定转染GH3和MtT／s细胞系的建立：首先把hGH基因调控序列(-484～+30bp)克隆到含荧光素酶报告基因的质粒载体pGL3-Basic中，得到含hGH基因启动子-484～+30bp序列的荧光素酶表达质粒484-luc2。然后把这一质粒用脂质体转染法，转染到垂体GH3和MtT／S细胞中，经筛选药物G418筛选，获得稳定表达荧光素酶的稳定转染GH3和MtT／S细胞系。 2．细胞因子对垂体细胞GH分泌和合成的影响：采用酶免疫分析法，在垂体GH3细胞中加入细胞因子刺激4h后，观察到IFN-γ(10~2和10~3u／ml)、IL-1β(10、10~2、10~3和10~4u／ml)、IL-6(10~2、10~3和10~4u／ml)、IL-11(20nM)、CNTF(10nM)能显著刺激GH分泌，促进GH合成。其中IL-6的刺激作用最强，10~4u／ml的IL-6能使GH分泌增加到对照组440％，GH合成增加到对照组的418％。而TGF-β(5nM)和激活素(5nM和50nM)能明显减少GH分泌，抑制GH合成。50nM的激活素分别抑制GH分泌和合成到对照组的56％和59％。在MtT／S细胞中也获得了与GH3细胞相似的实验结果。
3．细胞因子对垂体细胞中hGH基因启动子的影响：含有hGH基因启动子序列和荧光素酶报告基因的质粒，其荧光素酶的表达受hGH基因启动子活性的控制。
第一部分：福辛普利和氯沙坦对心力衰竭大鼠心功能的作用 目的 用超声心动图技术评价福辛普利和氯沙坦对心力衰竭大鼠的左心室功能的作用。方法 36只慢性心力衰竭大鼠分成：福辛普利[50mg／kg，qd]组(HF-F)(n=12)和氯沙坦[30mg／kg,qd]组(HF-L)(n=12)，另设对照组：生理盐水组(HF-C)(n=12)、假手术组(Sham)(n=8)。药物治疗8周，治疗前后行多普勒超声心动图检查。检测指标包括：左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)、左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)。结果 与假手术组比较，生理盐水组左室舒张末期内径(LVIDd)(5.82±0.93 vs 8.76±1.73mm，p＜0.001)、左室收缩末期内径(LVIDs)(2.48±0.79 vs 6.44±2.13mm，p＜0.001)、左室舒张末期容积(LVEDV)(0.268±0.101 vs 0.494±0.173ml，p＜0.01)和左室收缩末期容积(LVESV)(0.121±0.049 vs 0.315±0.140ml，p＜0.01)显著升高，左室射血分数(LVEF)(55.0±8.3％ vs 37.5±8.9％，p＜0.01)和短轴缩短率(FS)(57.